Métodos de Valoración Farmacopeica por HPLC: Cuantificación de Apigenina en Manzanilla y Alcaloides en Boldo

Posted on por

Manzanilla: Valoración de 7-O-glucósido de Apigenina

Valoración del Contenido de 7-O-glucósido de Apigenina

Sistema Cromatográfico

  • Emplear equipo cromatográfico de líquido con detector UV a 335 nm.
  • Utilizar una columna con fase estacionaria de octadecilsilano unido a partículas porosas de sílice.
  • Programar la fase móvil para obtener una composición variable de Solución A y Solución B según se indica:
    1. En el momento de la inyección, la proporción de Solución B corresponde al 26 %; mantener este nivel durante 3 minutos.
    2. Aumentar linealmente durante los siguientes 19 minutos hasta el 85 % de Solución B.
    3. Disminuir linealmente durante los siguientes 5 minutos hasta el 26 % de Solución B.
    4. Mantener esa composición durante los siguientes 3 minutos antes de la próxima inyección.
  • El caudal debe ser aproximadamente 1 ml por minuto.

Reactivos y Soluciones

  • Ácido Fosfórico Diluido: Transferir 5,0 ml de ácido fosfórico a un matraz aforado de 100 ml, agregar 50 ml de agua, diluir y mezclar.
  • Solución A: Preparar solución de fosfato monobásico de potasio (K) 0,5 M. Ajustar con Ácido Fosfórico Diluido a pH 2,55 ± 0,05.
  • Solución B: Preparar mezcla de acetonitrilo y metanol (65:35).

Preparación Estándar

Disolver una cantidad exactamente pesada de 7-O-glucósido de apigenina y 7-metoxicumarina en metanol y diluir cuantitativamente y en etapas, si fuera necesario, con metanol hasta obtener una solución con una concentración de 25,0 µg de 7-O-glucósido de apigenina y 10,0 µg de 7-metoxicumarina por ml.

Preparación Muestra

  1. Pesar 1,0 g de manzanilla, transferir a un Erlenmeyer equipado con refrigerante y agitador.
  2. Agregar 80,0 ml de metanol, y calentar la mezcla a reflujo con agitación durante 1 hora.
  3. Enfriar el Erlenmeyer a temperatura ambiente, filtrar la solución metanólica a través de papel de filtro plegado y recoger el filtrado en un matraz aforado de 100 ml.
  4. Lavar el matraz con 3 ml de metanol, verter los lavados a través del papel de filtro y agregar el filtrado al matraz aforado.
  5. Diluir con metanol a volumen, mezclar y filtrar.
  6. Transferir 25,0 ml de la solución filtrada a un balón equipado con refrigerante y agitador.
  7. Agregar 5,0 ml de solución de NaOH (preparada mediante disolución de 0,4 g de NaOH en 5,0 ml de agua) y calentar la mezcla a reflujo durante 25 minutos.
  8. Enfriar el balón y ajustar la solución con HCl a un pH entre 5,0 y 6,2.
  9. Transferir cuantitativamente la solución a un matraz aforado de 50 ml, diluir con metanol a volumen, mezclar y filtrar, descartando los primeros 10 ml del filtrado.

Aptitud del Sistema

Cromatografiar aproximadamente 15 µl de la Preparación Estándar. Realizar los ajustes necesarios para obtener tiempos de retención relativos de aproximadamente 0,63 y 1,0 para 7-O-glucósido de apigenina y 7-metoxicumarina, respectivamente. Registrar los picos según se indica en Procedimiento:

  • La resolución (R) entre 7-O-glucósido de apigenina y 7-metoxicumarina no debe ser menor de 3,5.
  • La desviación estándar relativa para inyecciones repetidas no debe ser mayor de 2,0 %.

Procedimiento

Inyectar por separado en el cromatógrafo un volumen (aproximadamente 15 µl) de la Preparación Estándar y la Preparación Muestra. Dejar eluir la Preparación Muestra por lo menos seis veces el tiempo de retención de 7-O-glucósido de apigenina. Registrar los cromatogramas y medir las respuestas de todos los picos observados en el cromatograma de la Preparación Muestra.

Los tiempos de retención relativos deben ser aproximadamente:

  • 0,30: 7-O-glucósido de apigenina
  • 0,47: 7-metoxicumarina
  • 0,66: Apigenina
  • 0,89: trans-espiroéter
  • 1,0: cis-espiroéter

Calcular el porcentaje de 7-glucósido de apigenina en la porción de Manzanilla en ensayo, mediante la fórmula siguiente:

$$\text{Porcentaje} = 12 \times \frac{C}{P} \times \frac{r_M}{r_E}$$

Donde:

  • C es la concentración en mg por ml de 7-O-glucósido de apigenina en la Preparación Estándar.
  • P es el peso en gramos de Manzanilla en ensayo para la Preparación Muestra.
  • $r_M$ y $r_E$ son las respuestas de los picos de 7-O-glucósido de apigenina obtenidos a partir de la Preparación Muestra y la Preparación Estándar, respectivamente.

Boldo: Valoración de Aceites Esenciales y Alcaloides

Valoración de Aceites Esenciales

Realizar la determinación de aceites esenciales por métodos farmacognósticos. Pesar 10 g de Boldo en polvo y transferir a un balón de 1 litro. Destilar con 300 ml de agua y recolectar empleando 0,5 ml de xileno en un tubo graduado, a una velocidad de 2 a 3 ml por minuto durante 2 horas.

Valoración de Alcaloides

Sistema Cromatográfico

El sistema es igual al descrito para Manzanilla, pero el caudal debe ser aproximadamente 1,5 ml por minuto.

Fase Móvil y Soluciones

  • Solución A: Preparar mezcla de 99,8 ml de agua y 0,2 ml de dietilamina. Ajustar a pH 3 con ácido fórmico.
  • Solución B: Preparar mezcla de 99,8 ml de acetonitrilo y 0,2 ml de dietilamina.
  • Fase Móvil: Solución A y Solución B (84:16). Filtrar y desgasificar. Realizar los ajustes necesarios.

Preparación Estándar

Preparar una solución de boldina en la Fase Móvil con una concentración de 0,012 mg por ml.

Preparación Muestra

  1. Pesar 1 g de polvo, agregar 50 ml de ácido clorhídrico, agitar y calentar en baño de agua a 80 ºC durante 30 minutos.
  2. Filtrar, y repetir la operación.
  3. Filtrar, reunir los líquidos filtrados fríos y agitar con 100 ml de mezcla de acetato de etilo y hexano (5:5).
  4. Ajustar la fase acuosa a pH 9,5 con amoníaco diluido.
  5. Agitar sucesivamente con 100 ml, 50 ml y 50 ml de cloruro de metileno.
  6. Reunir las fases orgánicas y evaporarlas a presión reducida.
  7. Transferir el residuo a un matraz aforado de 10 ml y diluir a volumen con Fase Móvil.

Aptitud del Sistema

Cromatografiar la Preparación Estándar y registrar las respuestas de los picos según se indica en Procedimiento:

  • Los tiempos de retención relativos a la boldina deben ser: 0,9 para isoboldina, 1,8 para isocorydina N-óxido; 2,2 para laurotetanina; 2,8 para isocorudina y 3,2 para N-metillaurotetanina (pueden aparecer picos adicionales).
  • La desviación estándar relativa para inyecciones repetidas no debe ser mayor de 2,0 %.

Procedimiento

Inyectar por separado en el cromatógrafo 20 µl de la Preparación Muestra y la Preparación Estándar, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos.

Calcular el contenido en porcentaje del total de alcaloides, expresado como boldina, en la porción de Boldo en ensayo mediante la fórmula siguiente:

$$\text{Porcentaje} = \frac{\sum r_i}{r_E} \times \frac{P_E}{P_M}$$

Donde:

  • $\sum r_i$ es la suma de las respuestas de los picos correspondientes a los alcaloides identificados en el cromatograma obtenido con la Preparación Muestra.
  • $r_E$ es la respuesta del pico correspondiente a la boldina en el cromatograma obtenido con la Preparación Estándar.
  • $P_M$ es el peso de la muestra expresado en mg en la Preparación Muestra.
  • $P_E$ es el peso de la boldina en mg en la Preparación Estándar.