1. PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa

Es una técnica in vitro de amplificación de ADN que permite obtener millones de copias iguales de un fragmento concreto a partir de una cantidad mínima de ADN molde. Fue ideada por Kary Mullis en 1983.

Componentes de la PCR

• ADN molde: Contiene el fragmento de interés. Debe tener un alto grado de integridad y estar libre de contaminantes (cantidad orientativa: 100–300 ng).
• ADN polimerasa: Enzimas termoestables (ej. Taq polimerasa de Thermus aquaticus). Añaden nucleótidos al extremo 3’ en presencia de Mg²⁺. Temperatura óptima: 70–75 ºC.

Capacidades enzimáticas

• Sin actividad correctora: Actividad exonucleasa 5’→3’ pero no 3’→5’. Tasa de error: 1 por cada 100.000 nucleótidos.
• Con actividad correctora: Actividad exonucleasa 5’→3’ y 3’→5’. Tasa de error: 1 por cada millón. Útiles en PCR de alta fidelidad.
• Transcriptasa inversa: Pueden usar ARN como molde en presencia de iones manganeso.

Primers o cebadores

Oligonucleótidos monocatenarios (10–30 bases) complementarios a las regiones que flanquean el fragmento. Se diseñan por parejas:

• Forward (F): Se une a la hebra 3’→5’.
• Reverse (R): Se une a la hebra 5’→3’.

Ciclo básico de la PCR

1. Desnaturalización (94–95 ºC): Separación de las hebras del ADN molde.
2. Hibridación (50–65 ºC): Unión de los primers al ADN molde.
3. Extensión (72 ºC): Síntesis de la nueva cadena por la polimerasa.

2. Modalidades de PCR y Visualización

Otras modalidades

• Hot Start PCR: Elimina la actividad de la enzima a bajas temperaturas.
• PCR múltiple (multiplex): Amplifica varias secuencias diana a la vez.
• RT-PCR: PCR con transcripción inversa.

PCR a tiempo real (qPCR)

Monitoriza la amplificación en cada ciclo mediante fluorocromos. Presenta tres zonas cinéticas: ruido, exponencial y meseta.

3. Técnicas de Hibridación

La hibridación es la unión de dos moléculas monocatenarias por complementariedad de bases. Factores como la fuerza iónica, agentes desnaturalizantes (DMSO, formamida) y el mismatch afectan la temperatura de fusión (Tm).

Técnicas principales

• Southern blot: Detección de ADN.
• Northern blot: Detección de ARN.
• Microarrays: Análisis simultáneo de miles de genes.

4. Extracción y Purificación de Ácidos Nucleicos

El proceso requiere un pretratamiento según la muestra (sangre, tejidos, bacterias) para obtener un lisado homogéneo. Los componentes clave de la lisis incluyen detergentes (SDS), EDTA, proteasas y agentes caotrópicos.

Métodos de purificación

• Solventes orgánicos: Mezcla de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico.
• Salting-out: Precipitación de proteínas mediante altas concentraciones salinas.
• Cromatografía: Intercambio iónico o adsorción en sílice.
• Esferas magnéticas: Unión específica o por adsorción.
• Ultrafiltración: Retención por tamaño de membrana.