Hibridación:

uníón de las cadenas de ADN i ARN (combinaciones) x formación d puentes H (AT-CG-AU x a ARN).

Secuencia diana:

cadena de ADN/ARN que se quiere detectar

Sonda:

cadena que añadimos a la muestra y q es complementaria a la cadena q se quiere identificar// SEÑAL:

1) Radioactividad → radiografía (fotografía con material sensible a los rayos X)(peligrosa),,
2)Fluorescencia → Microscopio de fluorescencia + fotografía (se pierde con el tiempo),, 3)
Hapteno → Inspección visual directa / Microscopio óptico + fotografía (aglutinación i reacción enzimática)

Sensibilidad:

capacidad distinguir la señan de un fondo o la mínima cantidad que se puede detectar,, a igual cantidad d sonda, la señal radioactividad y fluorescencia +sensibilidad q tecincas cromogenicas. // Especificidad:
capacidad de una sonda de diferenciar entre 2 dianas diferentes,, la q + es aquella q diferencia 2 cadenas diferenciadas d 1 base. Se basa en el mecanismo de complementariedad d bases.

Tª fusión:

Punto de desnaturalización al 50%, donde se ha desnaturlalizado la mitad de las cadenas de ADN bicatenario.
Sonda y diana separaddas al 50%, del total un 50% ya se ha abierto, 50% de todas las uniones sonda diana.,, en mol grandes tne relación con mum bases GC.

Factores hibridación: 1)

concentración salina: facilita hibridación xq fuera iónica estabiliza uniones doble cadena ácidos nucleicos de diana-sinda(augmenta tmp hibridacion9//
2)Agente desnaturalizante (dmso, formamida): dificulta hibridación xq deshace los puentes hidrógeno(disminuye tmp hib)//
3)grado bismatch: cantidad de nucleótidos no emparejados entre ADN/ARN de diana y sonda,, mayor grado dificulta hibridación (mayor grado, menor tmp hib)//
4)ph: ph básico dificulta la hibridación x adición de oh al medio que rompen puente hidrógeno.

Rigurosidad hibridación:

condición rigu baja,, se quiere conseguir q la cantidad sonda hibridada cn diana sea la máxima propiciando la hibridación incluso no especifica al 100%,,
1)Temperatura aproximadamente Tm – 25 ºC
2) Alta concentración salina (hasta SSC 20x)
3) Baja concentración de formamida

Rigurosidad lavado posth:

condi rigu alta,, objetivo de q los híbridos sonda-diana q sean ttalmente complem se mantengan unidos y híbridos imperfectos con mismatch se eliminen,,
1)Temperatura más próxima a Tm (aproximadamente Tm – 15 ºC). Solo los híbridos Sonda-Diana que emparejen más perfectamente se mantendrán unidos.
2) Baja concentración salina (SSC 0.1x – 1x)
3)Alta concentración de formamida (hasta 50%).

Southern blot:

dif dot blot permite detectar + 1 secuencia diana a la vez// TRANSFER: 1)
Desnaturalización de la doble cadena de ADN para permitir la uníón de la sonda. La desnaturalizació se realiza mediante reacción en medio alcalino (hidróxido de sodio). ,,
2)Tranferencia propiamente dicha. Se produce por capilaridad desde el gel con los fragmentos de ADN hasta la membrana de nitrocelulosa. (Etapa larga horas – overnight).
3)Anclaje del ADN transferido a la membrana de nitrocelulosa. Se produce calentando a 80ºC o irradiando con luz ultravioleta.// BLOQUEO:
Bloqueo de los lugares de uníón de la membrana de nitrocelulosa libre para evitar uniones no específicas con las sondas. (explicar con un dibujo) para q no se marque toda.

Microarray:

expresio normal (mescla dos colors),, infraexpresio problema (ix color del bo o referencia),, sobreexpresio problema (ix color problema)// detecta expresión génica de una población celular i detectar deleciones y duplicaciones

Fish(hibridación in situ fluorescente):

xmite dtectar alteración cromosomica numéricas (monosomías, tri, poli) y estructurales (transl, del, inserc)//
1)trans  adn interf sonda fusión:
luz amarilla nos indica una alteración cromosómica, y la verde y roja cromosomas normales.,,
2)trans adn interf sonda separación:
Luz amarilla nos indica los cromosomas normales, y la desaparición de esta generando la luz verde y roja nos indica la alteración  cromosómica

Cish (hibridación in situ):

reacción cromogenica,, La señal es un colorante que se deposita en la sonda, en este caso las sondas utilizadas desencadenan una reacción cromogénica,, La sonda esta unida a una enzima a la cual le ponemos un sustrato que cuando actúan producen un colorante que se  deposita en la zona sonda-diana. (diapositivas) //Esta tecnología se utiliza cuando no es practicable la tecnología FISH en muestras FFPE (formalin-fixed paraffin embedded) ya que el formaldehído provoca una fluorescencia de fondo que no permite diferenciar entre las sondas fluorescentes.