Introducción
El semen es el producto de la secreción procedente de los testículos, el epidídimo, la vesícula seminal y la próstata.
El semen normal está compuesto de una suspensión de espermatozoides en un medio líquido que le proporciona los nutrientes y las condiciones físico-químicas adecuadas para que los espermatozoides puedan desarrollar su actividad.
El producto final (eyaculado) es un líquido viscoso que está compuesto de cuatro fracciones que provienen de:
Fracciones del Eyaculado
Glándulas Bulbouretrales y Uretrales
Es una secreción alcalina compuesta por mucoproteínas, galactosa y ácido oxálico.
Fracción pre-eyaculatoria, 10-15 % del volumen.
Próstata
Segrega un líquido lechoso, ácido (pH: 6,2-6,8), que contiene fosfatasa ácida, ácido cítrico, albúmina, Zn y enzimas proteolíticas que actúan sobre los productos de secreción de las vesículas seminales provocando su coagulación y licuefacción.
Fracción previa, 20 % del volumen.
Testículos y Epidídimo
Los espermatozoides se producen en los testículos, maduran durante unas tres semanas en el epidídimo y son almacenados hasta la eyaculación o reabsorbidos si la eyaculación no se produce. Los espermatozoides corresponden a una pequeña cantidad del volumen total del semen.
Fracción principal, 5-10 % del volumen.
Vesículas Seminales
Producen un líquido opalescente, algo amarillento, viscoso y alcalino que proporciona fructosa y otros nutrientes para los espermatozoides. Otros componentes son prostaglandinas, lactoferrina y bicarbonato.
Constituye el mayor volumen del total y su función es la producción de ATP en las mitocondrias del espermatozoide y con ello la motilidad y viabilidad de los espermatozoides.
Fracción final, 50-60 % del volumen.
En el momento de producirse la eyaculación, los espermatozoides son impulsados a través del conducto deferente y del conducto eyaculador, donde se unen a las secreciones producidas por las vesículas seminales y próstata, hasta su expulsión a través de la uretra.
El líquido seminal recién emitido no tiene una composición uniforme y únicamente cuando se ha producido la licuación es adecuado para realizar su análisis.
El líquido seminal se recibe en el laboratorio para practicar 3 tipos de análisis fundamentalmente:
Aplicaciones del Estudio Seminal
- Valoración de casos de infertilidad (evaluación de la calidad del semen).
- Post-vasectomía.
- Identificación de semen (medicina legal).
Recogida de Muestra
Condiciones de Recogida y Envío
Debe entregarse a los pacientes una hoja de instrucciones escrita con claridad sobre la manera de recoger el semen y trasladarlo. En el formulario que acompaña a cada análisis de semen debe constar:
- Nombre del paciente.
- Período de abstinencia.
- Fecha y hora de recepción (fundamental).
Igualmente, el recipiente debe rotularse con el nombre del sujeto, la fecha y hora de recolección y la duración de la abstinencia.
La muestra debe ser recogida a primera hora de la mañana y entregada al laboratorio antes de 60 minutos desde el momento de la obtención y la totalidad de la muestra.
La muestra será revisada, etiquetada e introducida en una estufa a 36ºC.
Abstinencia sexual de 3 días.
La muestra debe ser recogida previo lavado de manos y genitales.
Debe recogerse la totalidad del líquido eyaculado; las muestras incompletas no se deben analizar, especialmente si se pierde la primera porción del eyaculado.
La recogida se realiza en un recipiente atemperado.
En caso de determinaciones de movilidad es necesario conservar a **37º C**. Deben evitarse las temperaturas extremas (no menos de 20º C ni más de 40º C) durante el traslado al laboratorio, siendo adecuada la temperatura corporal (es importante para que se complete la licuación del coágulo). Las analíticas se tienen que iniciar cuando está licuado completamente.
Es conveniente que la muestra se recoja en la intimidad de una dependencia próxima al laboratorio mediante masturbación para proceder al análisis de forma rápida.
La recogida en el laboratorio permite un examen completo del semen, especialmente del proceso de coagulación y licuación, y evita la posibilidad de un golpe de frío (el recipiente debe calentarse previamente a temperatura corporal). Si esto no es posible, debe llegar al laboratorio dentro de la 1ª hora después de su extracción y se debe preguntar y anotar la hora de la obtención porque a los 15 minutos el semen empieza a licuarse y el tiempo transcurrido es esencial para valorar la licuación.
Condiciones para Muestras Post-Vasectomía
- Después de más de 20 eyaculaciones.
- Debe recogerse el total del eyaculado por masturbación.
- No utilizar pomadas ni enjuagar el pene desde 8 horas antes de la recogida de la muestra.
- Realizar el estudio antes de 4 horas.
- Primer análisis a las 16 semanas post-vasectomía.
- Dar como concluido el estudio después del segundo análisis negativo.
Normas de Seguridad en el Manejo de Muestras
- Los trabajadores del laboratorio deben conocer que **las muestras de semen pueden contener virus patógenos** (por ejemplo, VIH, virus de la hepatitis y del herpes) y por consiguiente deben ser manejadas con cuidado.
- La **manipulación** de las muestras debe realizarse **como si cada muestra estuviese contaminada** con un virus de transmisión sexual u otro microorganismo infeccioso.
- El personal debe **lavarse las manos** con jabón desinfectante y agua caliente luego de quitarse los guantes y/o bata. El lavado debe ser inmediato si las manos se contaminan con semen.
- Los guantes deben ser sacados y descartados cuando se sale del laboratorio o cuando se atiende al teléfono.
- Se debe utilizar bata que debe quitarse al salir del laboratorio y que no debe ser usada en otros ambientes.
- Se debe utilizar **material desechable** siempre que sea posible. Se eliminará en un recipiente especial que se deseche como material infectante.
- Se deben utilizar **guantes, bata y gafas de seguridad** cada vez que manipulen muestras de semen congelado (los contenedores pueden explotar al descongelarse).
- Todos los equipos del laboratorio que potencialmente puedan ser contaminados por semen o plasma seminal deben ser desinfectados o esterilizados al final de cada jornada y siempre que ocurra un derrame.
- Utilizar pipetas automáticas.
- En toda manipulación de semen se debe evitar la formación de gotas y aerosoles. Utilizar mascarillas cuando haya riesgo de formación.
Fase Analítica
Al recibir la muestra se deja a 37º C durante 20-25 minutos, agitando de vez en cuando durante 20-30 segundos para favorecer la licuefacción.
Tipos de Examen
Examen Macroscópico
4.1.1 Volumen
El volumen normal varía entre 2 y 5 ml (por término medio, 3,5 ml).
Se determina pasando la totalidad del líquido seminal desde el recipiente de recogida a una probeta o a un tubo de centrífuga graduado de 15 ml de capacidad por aspiración mediante una pipeta Pasteur y leyendo el volumen ocupado por el mismo.
4.1.2 Viscosidad/Consistencia
La muestra **debe haberse licuado por completo antes de observar la viscosidad**.
Cuando depositamos el semen en el tubo de centrífuga para medir el volumen, este cae desde la pipeta Pasteur **gota a gota** y no tiene aspecto aglutinado ni filamentoso.
En una muestra normal se observan **gotas pequeñas y bien definidas** mientras que en una muestra de consistencia aumentada se formará un filamento mayor de 2 cm.
Un **incremento de la viscosidad**, como sucede cuando hay un alto contenido de moco, **puede interferir en la determinación** de varias características del semen como la motilidad y la concentración, así como a la detección de anticuerpos unidos a la superficie de los espermatozoides.
En el informe se califica de 0 = acuoso a 4 = semejante a gel.
4.1.3 Filancia
Se determina **observando el filamento** que se forma al retirar la punta de una pipeta, una varilla fina o un asa de platino de la muestra que **no debe superar un centímetro de longitud**.
La presencia de hilos de moco es señal de licuefacción incompleta.
4.1.4 pH
Es **ligeramente alcalino** y sus valores oscilan entre 7,3 y 7,8 (7,2-8).
La **determinación** del pH debe realizarse dentro de los **60 minutos siguientes a la eyaculación** por la alcalinización que sufre la muestra.
Si la proporción de **líquido prostático** es anormalmente **alta**, el **pH** del semen **se acidifica**; **si predomina** la secreción de las **vesículas seminales**, el **pH** es **alcalino**.
4.1.5 Licuefacción
El **líquido seminal se coagula tras la eyaculación** por acción de una **enzima prostática** sobre un precursor semejante al fibrinógeno producido por las vesículas seminales.
El **líquido seminal a 37º C se licua en 20-30 minutos** debido a la acción de enzimas de origen prostático y a los 30 minutos debe estar completamente licuado. La **licuefacción anormal no tiene importancia clínica** pero **puede interferir en el análisis**.
Se informa como normal (licuado) o anormal (grumos, coágulos, hebras).
4.1.6 Color
La muestra debe ser examinada inmediatamente tras la licuefacción o dentro de los 60 minutos de eyaculada, por simple inspección a temperatura ambiente.
Una muestra **normal** tiene un **aspecto homogéneo blanquecino-opalescente o nacarado y muy viscoso en el momento de la eyaculación** y origina un líquido **translúcido, turbio y viscoso cuando ha licuado**.
Tras la licuación, se informa como:
- **NORMAL** (aspecto **gris opalescente**)
- Posible **AZOOSPERMIA** (**transparente**)
- Posible presencia de **LEUCOCITOS** (**amarillo**)
- Posible **HEMOSPERMIA** (**pardo-rojizo**)
Examen Microscópico
Material
- Microscopio óptico corriente (condensador alejado), pero es mejor utilizar un microscopio con óptica de contraste de fase y objetivos de 10, 20 y 40 aumentos para todo examen de muestras no teñidas.
- Placa atemperada a 37 ºC.
- Portaobjetos y cubreobjetos previamente atemperados a 37ºC.
- Pipetas automáticas (a ser posible de desplazamiento positivo para la muestra).
- Cámara de Neubauer Improved.
Debido a que la **motilidad** y la **velocidad** de los espermatozoides son muy dependientes de la temperatura, estas determinaciones deben hacerse a una temperatura próxima a los 37ºC calentando el porta en una estufa o utilizando una **platina termostatizada**. El resto de los exámenes debe ser realizado a temperatura ambiente, procurando estandarizarla entre 20 y 24 º C.
El examen microscópico valora el número y características de los espermatozoides de la muestra. Comprende el RECUENTO, MOTILIDAD, ÍNDICE DE VITALIDAD y FÓRMULA ESPERMÁTICA.
El examen microscópico se inicia con un **examen microscópico directo** que:
- **Orientará** en la realización de las posteriores determinaciones ya que permite una **estimación** de:
- la concentración y
- motilidad de los espermatozoides, de
- la presencia de aglutininas y de
- otras células, así como
- una primera orientación sobre la morfología de los espermatozoides.
Técnica del Examen Microscópico Directo
Para realizar el **examen microscópico directo** se deposita una gota (10 µl) de líquido seminal, previamente homogeneizado con una pipeta de plástico, sobre un porta.
Se coloca un **cubreobjetos** (22 × 22 o de 24 × 24 mm) sobre la muestra,
se permite la **estabilización de la muestra durante 1 minuto** y
se observa (con el microscopio a 40x por contraste de fases o campo claro): el número aproximado de espermatozoides, su movilidad, presencia de anormales, leucocitos, hematíes o cristales incoloros de espermina (tienen forma de aguja) que se forman con el tiempo debido a la reacción de la espermina de la secreción prostática con el ácido fosfórico originado por la degradación enzimática de fosfatos orgánicos.
Cuando el número de espermatozoides es muy bajo (1-2 por campo), la muestra debe ser **centrifugada**. Posibilidades:
- a) Un volumen de semen (el máximo que permita el eyaculado) se centrifuga a 600 g durante 15 minutos y luego se retira un volumen conocido de líquido seminal. Se procede al recuento de espermatozoides y se corrige el resultado final respecto al volumen inicial. La morfología y la motilidad también se efectúan con la muestra concentrada.
- b) Colocaremos 500 µl de la muestra en un tubo eppendorf y centrifugamos a 3.500 rpm durante 5 minutos: se decanta el sobrenadante y después de homogeneizar las células sedimentadas procedemos al estudio de la motilidad.
Si el número de espermatozoides es muy elevado, podemos **diluir** con el tampón PBS.
4.2.1 Recuento de Espermatozoides
Se determina con el **método del hemocitómetro** y los valores normales oscilan entre **20 y 160 millones de espermatozoides por mililitro**.
El recuento se puede realizar de forma automática o manual.
Recuento Manual
Se utiliza para realizar el recuento una cámara **Neubauer Improved**, siendo el procedimiento semejante al recuento de células sanguíneas o, si no se diluye la muestra, en la cámara de **Makler**.
Recuento en Cámara Neubauer Improved
- 1º. **Homogeneizar** la muestra mediante una varilla agitadora.
- 2º. **Dilución** de la muestra.
Se utiliza como diluyente la **solución de Macomber y Saunders** (formol al 40 % 1 ml, bicarbonato sódico 5 g, agua destilada 100 ml) o con el **diluyente de Weigman** (solución de 50 g de bicarbonato sódico y 10 ml de formalina al 35%) que **inmoviliza** y conserva las células.
La dilución de la muestra puede realizarse de varias formas:
- a) Utilizando la **pipeta de Thoma para leucocitos (color blanco)**.
- b) Mediante **pipeta automática** (preferentemente de desplazamiento positivo).
Pipeta de Thoma (para leucocitos)
Se aspira la muestra hasta la señal 0,5 y el líquido diluyente hasta la señal 11 (pipeta de mezcla para leucocitos); se homogeneiza la muestra agitando la pipeta y antes de cargar la cámara se desecha hasta la señal 1.
Pipeta Automática
Si en el examen en fresco se observan 10 a 40 espermatozoides por campo se diluye 1/5 (coger 50 µl de semen bien homogeneizado y 200 µl de solución diluyente).
Si se observan más de 40 espermatozoides por campo en el examen en fresco, la dilución debe ser 1/20 (50 µl de semen bien homogeneizado y 950 µl de solución diluyente)
Técnica de Carga de la Cámara
Mezclar bien la muestra con la pipeta (a ser posible de desplazamiento positivo) y se añade al diluyente en un tubo de tapón hermético. Mezclar (al menos 10 segundos) en un vortex inmediatamente antes de cargar la cámara del hemocitómetro.
- 3º. **Carga de la cámara de recuento**:
a) Si la dilución se realiza mediante la **pipeta de Thoma**, después de desechar las primeras 3 o 4 gotas (hasta la señal 1 de la pipeta), se pone en contacto la pipeta en cada una de las dos zonas de la cámara de Neubauer Improved, procediendo al llenado de la misma por capilaridad (10 µl). Dejar reposar durante dos o tres minutos en **cámara húmeda** (una placa de Petri con una torunda de algodón o papel de filtro humedecido) para favorecer que los espermatozoides sedimenten en la cuadrícula.
b) Si no se ha utilizado la pipeta de Thoma, se mezcla la muestra diluida en el tubo de ensayo o tubo con tapón hermético) y mezclar al menos durante 10 segundos en un vortex. Se depositan dos alícuotas de 10 µl en cada una de las dos zonas de la cámara de Neubauer cuadriculadas. Se coloca un cubre de 24 × 24 mm y se deja **reposar** durante dos o tres minutos en cámara húmeda para favorecer que los espermatozoides sedimenten.
- 4º. **Observación con microscopio**:
Se utiliza el **microscopio óptico** o de **contraste de fases**.
Para determinar el número de cuadrados que se deben contar, se debe contar el número de espermatozoides en el **cuadrado superior de la esquina izquierda**. Para las muestras que contienen menos de 10 espermatozoides por cuadrado se debe contar toda la rejilla, es decir **25 cuadrados**; si la muestra contiene de 10 a 40 espermatozoides por cuadrado pueden estudiarse **10 cuadrados** y para las que contiene más de 40 espermatozoides por cuadrado es suficiente analizar **5 cuadrados**.
Los espermatozoides se cuentan en las dos cámaras del hemocitómetro; si la diferencia supera el 10% se realiza otra dilución.
Los espermatozoides sin cabeza o las cabezas solas no se cuentan.
La Cámara de Neubauer Modificada
tiene cuatro cuadros en las esquinas que miden 1 mm de lado y están divididos en 16 cuadrados pequeños de 0,25 mm de lado, siendo la profundidad 0,1 mm.
El **cuadrado central** de la rejilla del hemocitómetro de Neubauer (**1 mm²**) contiene **25 cuadrados grandes** y cada uno de ellos contiene **16 cuadrados más pequeños**.
Técnica de Conteo
- 1. Enfocar con objetivo de 4x.
- 2. Ubicarse en la cuadrícula central y pasar a objetivo de 10x. Comprobar que la distribución de los espermatozoides es homogénea y que no hay espermatozoides aglutinados.
- 3. En esta cuadrícula se visualizan 25 cuadrados. Si se cuentan las células de 5 campos, generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el cuadro central (garantiza un conteo aleatorio).
- 4. Pasar a objetivo de 40x para visualizar cada uno de ellos.
- 5. Las células se cuentan cuadro a cuadro siguiendo las **flechas** para evitar contar las células dos veces o que no se cuenten.
Alrededor de cada cuadrícula se observa que hay tres líneas que delimitan el cuadro (son fundamentales en el momento del conteo ya que definen las células contables o cuáles están fuera del campo de conteo):
- las células que no tocan la segunda línea son contables;
- si la tocan o están encima de ella no se incluyen.
Gráficamente se puede apreciar la forma correcta del conteo. Las células que tienen una X son las que no se deben contar.
Cálculo del Número de Espermatozoides
Al cuantificar el número de espermatozoides hay que tener en cuenta el volumen de cada cuadrado:
Volumen de cada cuadrado contado: 1 mm × 1 mm × 0,1 mm (profundidad) = 0,1 mm³.
Los cálculos a realizar corresponden a multiplicar el número de espermatozoides contados en 1 mm² por 10 (para obtener el resultado en mm³) por la dilución realizada y por 1.000 para obtener los resultados en ml.
**Espermatozoides/ml = nº de espermatozoides (1mm²) × dilución × 10 × 1000.**
Del mismo modo se cuentan las células redondas (células inmaduras germinales y células inflamatorias) que luego se diferencian al fijar y teñir.
Otra Posibilidad para Recuento de Espermatozoides (OMS)
Se divide el promedio del recuento (número de espermatozoides contados en cada cámara) por el factor de conversión que aparece en la tabla A.
Por ejemplo, si la muestra fue diluida 1+19 y se contaron 162 y 170 espermatozoides en 10 cuadrados grandes de cada cámara, la concentración de la muestra original es de 83 x 10⁶/ml (166 dividido por 2).
Recuento en Cámara de Makler
La **cámara de Makler** es una cámara diseñada específicamente para el recuento de espermatozoides **móviles** por mililitro.
La cámara de Makler consta de una zona redonda, donde se deposita la muestra y cuatro soportes donde apoya el cubre y un **cubre reticulado** (la superficie reticulada es de 1 mm² dividida en 100 cuadros de 0,1 × 0,1 mm).
Presenta la ventaja de:
- no requerir dilución previa de la muestra (excepto si la concentración de espermatozoides es muy elevada),
- facilita la visualización de los espermatozoides en un único plano y la obtención del número de espermatozoides/ml se obtiene sin necesidad de realizar cálculos, pero tiene menos precisión que la técnica del hemocitómetro.
Técnica en Cámara de Makler
- Se procede a inmovilizar los espermatozoides (opcional) sometiendo una alícuota de la muestra al baño maría durante 5 minutos (no si queremos valorar la movilidad).
- Se deposita **una gota** en la cámara.
- Se coloca el cubreobjetos sobre los soportes (provoca el desbordamiento del semen que excede de **200** µl por los canales circundantes). Los espermatozoides quedan dispuestos en un solo plano (la profundidad de la cámara es de 10 micras) y conservan la motilidad.
- Observar con microscopio a **20x**.
- Contar el número de espermatozoides en **10 cuadros**.
- La cifra contada equivale al número de espermatozoides en millones/ml.
Recuento de Células Redondas
En el eyaculado se encuentran, además de espermatozoides, otros tipos de células como:
- las células del tracto uretral (poligonales)
- células de espermiogénesis y
- los leucocitos.
Estas células han recibido el nombre genérico de **células redondas**.
Su estimación se realiza de la misma forma que el recuento espermático mediante **hemocitómetro**, siendo importante valorar y diferenciar los leucocitos.
Un eyaculado normal no debe tener más de **5 x 10⁶ células por mililitro**, no siendo el número de leucocitos superior a **1 x 10⁶ millones por mililitro**.
4.2.2 Movilidad (Motilidad)
El espermatozoide para llegar a fecundar un óvulo debe recorrer un largo camino que realiza mediante el impulso de los movimientos ondulatorios en sentido antero-posterior de su flagelo, que realiza con una frecuencia de unos 10 movimientos por segundo. La energía la obtiene por la actividad de las mitocondrias para producir ATP.
El estudio de la movilidad debe realizarse lo antes posible para evitar alteraciones causadas por el descenso de la temperatura o la deshidratación de la preparación, sobre todo en los bordes.
La determinación de la movilidad puede realizarse mediante: observación directa o con analizadores de calidad del esperma.
Estudio de la Movilidad mediante Observación Directa
Se practica con la **muestra sin diluir** contando todos los **espermatozoides móviles e inmóviles** en varios campos, evitando los campos cercanos a los extremos del portaobjetos, utilizando un objetivo de 40x y determinando el **porcentaje** de espermatozoides que muestran motilidad activa dentro de las primeras tres horas de su obtención.
Si más de un **25%** de los espermatozoides se encuentran **agregados**, la valoración de la movilidad se realizará solo con los espermatozoides libres, haciendo constar en el informe este problema. Las cabezas sin flagelo **no** deben contarse.