Fundamentos de Microbiología, Técnicas de Laboratorio y Depuración de Aguas Residuales

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Fundamentos de Bioseguridad y Gestión de Riesgos

Conceptos básicos: biopeligrosidad, microorganismo, agente biológico, símbolo de peligrosidad y vías de infección (cutánea, respiratoria, digestiva y parenteral).

Clasificación y Equipamiento

  • Grupos de riesgo: 1, 2, 3 y 4.
  • Cabinas de seguridad: Clase 1 (filtro HEPA), Clase 2 y Clase 3 (la más segura).
  • Niveles de bioseguridad: Su objetivo es identificar y evaluar riesgos, así como minimizar los mismos.

El Autoclave: Procedimiento de Esterilización

Para un uso correcto del autoclave, se deben seguir estos pasos:

  1. Ajustar temperatura, presión y tiempo.
  2. Llenar de agua destilada hasta la rejilla e introducir el material.
  3. Cerrar el autoclave y abrir la llave de purga.
  4. Interrumpir el encendido y cerrar la llave de purga.
  5. Controlar la presión.
  6. Abrir la llave de purga para que salga el vapor.
  7. Sacar el material utilizando guantes especiales.

Microscopía Óptica: Propiedades y Manejo

Propiedades del Microscopio

  • Amplificación: Aumento total de la imagen.
  • Poder de resolución y límite de resolución: Capacidad para distinguir dos puntos cercanos.
  • Apertura numérica: Capacidad de captación de luz.
  • Profundidad de campo: Espesor de la preparación enfocada en cualquier momento.
  • Área de campo: Diámetro de la parte de la preparación que se está viendo.

¿Cómo se ajusta la iluminación del microscopio óptico? Se realiza mediante el condensador, el diafragma y el control de la intensidad de la luz.

Partes del Microscopio

  • Soporte: Base, soporte, brazo, platina y tornillos de la platina.
  • Sistema de iluminación: El condensador, el diafragma y la fuente de luz.
  • Elementos ópticos: Oculares, objetivos de pequeño y gran aumento, y objetivo de inmersión.

Crecimiento Celular y Medios de Cultivo

Fases del Crecimiento Celular

Las fases de una célula en cultivo son: latencia, exponencial, estacionaria y muerte.

Factores del Medio de Cultivo

Para un desarrollo óptimo se requieren: nutrientes, O2, humedad, luz, pH y temperatura.

  • Fuentes de Carbono: Autótrofa (orgánica), fotolitótrofas (luz), quimiolitótrofas (reacciones químicas) y heterótrofas (fotoorganótrofas y quimioorganótrofas).
  • Requerimientos de Oxígeno: Aerobios estrictos, anaerobios estrictos, facultativos, microaerófilos y carboxífilos.
  • Temperatura: Psicrófilas (debajo de 20°C), mesófilas (entre 20 y 45°C) y termófilas (encima de 45°C). La temperatura óptima suele oscilar entre 30 y 43°C.

Componentes y Clasificación de los Medios de Cultivo (M.C.)

Componentes: Nutrientes y energéticos, tampones, factores de arranque y de crecimiento, agentes solidificantes (para observar mejor las características), agentes reductores, selectivos e indicadores ácido-base.

Clasificación:

  • Por consistencia: Líquido, sólido y semisólido.
  • Por utilización: Medios ordinarios, enriquecidos, especiales, selectivos, de identificación y diferenciales.

Pruebas Bioquímicas de Identificación

Prueba de Oxidasa

Permite poner de manifiesto la enzima citocromo oxidasa. Esta enzima cataliza la cesión de electrones desde el sustrato al oxígeno en la cadena respiratoria bacteriana. Se utiliza el reactivo de Kovacs-oxidasa (derivado de la p-fenilendiamina).

  • Resultados: Oxidasa (+): Desarrollo de color negro o púrpura (Control: Pseudomonas). Oxidasa (-): Sin cambio de color (Control: Escherichia coli).

Prueba de Catalasa

Comprueba la existencia de la enzima catalasa, presente en la mayoría de bacterias aerobias y anaerobias facultativas (excepto Streptococcus). Al añadir peróxido de hidrógeno, se produce desprendimiento de oxígeno.

  • Resultados: Catalasa (+): Formación de burbujas (Control: Staphylococcus). Catalasa (-): Sin burbujas (Control: Streptococcus y Clostridium).

Prueba IMViC

Conjunto de cuatro pruebas para la identificación de enterobacterias:

  1. Indol: Determina la capacidad de producir indol a partir del triptófano.
  2. Rojo de Metilo: Capacidad de producir ácidos estables por fermentación ácida mixta.
  3. Voges-Proskauer: Determina la producción de acetoin (producto neutro). En medio alcalino y con O2, se oxida a diacetilo, que con α-naftol da un color rojo-fucsia.
  4. Citrato: Indica si el microorganismo usa el citrato como única fuente de carbono, manifestado por un viraje de color.

Prueba de Kligler (KIA)

Sistema multiprueba que averigua: producción de ácido y gas (a partir de glucosa y lactosa) y producción de ácido sulfhídrico (H2S).

Métodos de Siembra y Recuento de Microorganismos

Siembra en Superficie con Asa de Vidrio

Consiste en depositar una muestra (aprox. 0,1 mL) sobre agar sólido en una placa de Petri y extenderla con un asa de Drigalski mediante movimientos de vaivén y rotación.

Procedimiento:

  1. Preparar diluciones.
  2. Depositar 0,1 mL con pipeta estéril (de mayor a menor dilución).
  3. Extender con el asa flameada con alcohol.
  4. Dejar reposar 15 min e incubar en posición invertida.

Recuento en Placa: Interpretación

Se contabilizan colonias de aprox. 1 mm. El rango óptimo es de 30 a 300 colonias. Si supera las 300, se realiza una estimación (contando un cuadrante y multiplicando por 4). Los resultados se expresan en UFC/mL con dos cifras significativas.

Filtración sobre Membrana

Se pasan volúmenes de muestra líquida por filtros de acetato de celulosa (poro menor al diámetro bacteriano). El filtro se incuba en placa Petri. Se recomienda un recuento de entre 20 y 100 colonias por filtro. Se aplica en análisis de aguas para coliformes y estreptococos fecales.

Número Más Probable (NMP)

Método de siembra en tubos con medio líquido. Consta de una fase presuntiva (presencia de gas) y una fase confirmativa en medios selectivos (como Agar M-Endo-Les para coliformes totales a 37°C o Agar M-FC para fecales a 44°C). Los resultados se obtienen mediante tablas estadísticas de NMP.

Tratamiento de Aguas Residuales

Tratamientos Primarios

Su objetivo es eliminar sólidos en suspensión y reducir la carga orgánica biodegradable.

  • Decantación primaria: Eliminación de sólidos sedimentables por gravedad.
  • Tratamientos fisicoquímicos: Uso de reactivos para coagulación-floculación, eliminando sólidos coloidales.

Tratamientos Secundarios (Biológicos)

Uso de microorganismos en condiciones aerobias para oxidar la materia orgánica. Procesos involucrados:

  1. Oxidación: Obtención de energía.
  2. Síntesis: Creación de nuevo tejido celular.
  3. Respiración endógena: Consumo del propio tejido celular ante la falta de alimento.

Se realiza en Reactores Biológicos o Cubas de Aireación mediante aireadores mecánicos o difusores.

Tratamientos Terciarios

Tratamientos avanzados para reutilización o vertido en zonas exigentes. Incluyen filtración, procesos fisicoquímicos y eliminación biológica o química de nutrientes (nitrógeno y fósforo mediante sales de hierro o aluminio).

Parámetros de Calidad del Agua

  • Aceites y Grasas: Determinados por extracción con disolvente y evaporación.
  • Sólidos en suspensión: Partículas retenidas en filtros de 0,45 micras.
  • Demanda de Oxígeno: Medida a través de la DBO (Bioquímica) y DQO (Química).
  • Nitrógeno: Presente como nitrógeno orgánico, amoníaco, nitratos y nitritos (análisis espectrofotométrico).
  • Fósforo: Presente como fosfatos orgánicos y polifosfatos.
  • Organismos patógenos: Virus, bacterias, protozoos y helmintos. Se utilizan los coliformes como organismo indicador.