3
Hibridación o annealing
Temperatura variable de 30-65ºC (a mayor Tª mas especificidad, varia en función del cebador).
Contra mayor tamaño del cebador mayor tiempo de unión (mas puentes de H):
Sucede tras la desnaturalización a altas Tª (rotura de puentes de H entre bases nitrogenadas obteniendo 2 cadenas monocatenarias), al producirse el enfriamiento el ADN puede volver a formar puentes de H entre bases complementarias de manera espontanea, así podemos añadir fragmentos de ADN complementarios exogenos al genoma (cebadores, sondas). Se une el cebador o la sonda (contiene fluoroforo en la PCR en tiempo real) a la cadena de ADN monocatenaria por complementación de bases especifica y establece grupo OH libre en 3´ donde la polimerasa en la fase de extensión o elongación comienza a añadir nucleotidos. Cada cebador tiene una secuencia complementaria distinta, de ahí la importancia de su elección según el fragmento que se quiera amplificar.
Uso
PCR con cebadores y sondas (PCR tiempo real), clonación basada en células (tamaño de los fragmentos mayores a los que permite la sensibilidad PCR) y en transferencia a membranas.
Diseño de primers
Propiedades
Debe ser especifico (unión por complementariedad de bases) del fragmento de ADN, tras este se efecturara la dase de elongación en extremo 3´ por la polimerasa.
No se debe unir a otros fragmentos.
Tiene que tener afinidad suficiente para no sufrir desnaturalización en fase de elongación por el aumento de Tª.
Aumenta la especificidad con el aumento de tamaño (mayor num bases complementarias), así como la afinidad y el tiempo de hibridación.
El extremo 3´ donde se sitúa el OH libre que marca el inicio de la acción de la polimerasa debe estar libre.
Composición de bases
Contenido GC 40 a 60% y distribución uniforme de los cuatro nucleótidos.
3.1 Marcaje de sondas:
La sonda posee una región complementaria que varia entre especificas (todo) y no especificas (región bucle). Contiene fluoroforo unido al extremo 5´ y el quencher al 3´.
También se puede marcar con señal en extremo cadena ADN.
4
Electroforesis en geles
Técnica de separación de moléculas (ADN, ARN, proteínas) según tamaño y carga eléctrica (tamización por gel) en una cámara de electroforesis.
Puede ser tras una PCR o por fragmentos formados por endonucleasas de restricción. Esto es posible gracias a una matriz porosa por la que difunden las moléculas con carga atraídas por fuerzas eléctricas opuestas del electrodo, según el tamaño varia la velocidad de difusión y el avance por el gel que ofrece resistencia.
Tipos gel
a.
Poliacrilamida
Solo sirve para fragmentos cortos de ADN, tiene mas precisión en los resultados.
B
Agarosa
Formado por polisacárido en disolución buffer.
Para poder ver el avance de las partículas el gel o los fragmentos deben estar teñidos:
Tinción con SYBR
Agente intercalante mas seguro.
Bromuro de etidio
Agente intercalante que emite fluorescencia bajo luz UV.
Parámetros componentes analizables
Moléculas ADN doble cadena:
Se utiliza por ejemplo tras una PCR. Las moléculas de ADN tienen estructura lineal estable y carga negativa, es atraído por fuerzas eléctricas positivas del electrodo.
Moléculas ARN:
Posee carga negativa (atraído por electrodo positivo) pero son monocatenarias por lo que pueden formar estructuras alternas que dificultan la difusión por el gel. Se utiliza glioxal para evitar estas estructuras.
Proteínas
No tienen carga estable, varia según aa. Pueden formar estructuras variables que dificultan difusión por gel. Se utilizan alcoholes para prevenir formación estructuras variables, y soluciones ionicas (dodecil sulfato de sodio) o diferentes pH para dar carga negativa a las proteínas.
5
Transferencia a membranas
Tras la electroforesis se obtienen las partículas separadas según carga y tamaño, se transfieren a una membrana por atracción eléctrica para su visualización y análisis. Se utilizan diferentes métodos según si analizamos ADN, ARN o proteínas.
Uso
Identificación de los fragmentos deseados (contienen gen, alelo) por detección por fluorescencia mediante hibridación de sondas, o proteínas mediante formación inmunocomplejos.
A
Hibridación southern blot con ADN
Se requieren fragmentos pequeños, por lo que se deben digerir antes de la electroforesis con endonucleasas de restricción.
Proceso
1. El gel de electroforesis se introduce en disolución alcalina para desnaturalizar hebras ADN (romper enlaces puentes H entre bases complementarias formando fragmentos monocatenarios) y que puedan salir fácilmente del gel, se lava con disolución buffer como la de la electroforesis.
2. Se coloca membrana nitrocelulosa encima del gel y por atracción electrostática (tiene carga positiva y el ADN negativa) se transfieren el ADN haciendo una copia de la electroforesis.
3. Se realiza hibridación de la membrana con disolución que contiene sondas (contienen fluoroforo) complementarias especificas de los fragmentos de estudion. Se lava la membrana para eliminar sondas que no se unen.
4. Los fragmentos que han sido marcados se observara fluorescencia.
B
Hibridación northern blot con ARN
No se requiere digestión con endonucleasas ya que son fragmentos pequeños.
Proceso
Igual que en ADN.
Uso
Identificación de los fragmentos deseados por detección por fluorescencia mediante hidridacion de sondas, y la cantidad de ARN en diferentes tejidos.
C
Inmunotransferencia western con proteínas
No se requiere menor tamaño, solo el tratamiento recibido en electroforesis (alcoholes previenen formación estructuras y solución ionica para dar carga negativa).
Proceso
1. Se coloca membrana nitrocelulosa encima del gel y por atracción electrostática (tiene carga positiva y las proteínas negativas) se transfieren las proteínas haciendo una copia de la electroforesis.
2. Se realiza conjugación con anticuerpos específicos para formar inmunocomplejos que se quedan unidos a la membrana, se lava para limpiar Ac no unidos. 3. Para visualizar la unión proteína
Ac se utiliza disolución con enzima cromogenica que reacciona en presencia del Ac y produce coloración. Uso: Identificación de proteínas para saber su tamaño tras la electroforesis y su patrón de expresión del ARN precursor.
6
Secuenciación de nucleotidos DNA
Análisis de un fragmento de ADN para averiguar el orden de los nucleotidos que contiene. También alteraciones en nucleotidos (no habrá complementario) ya que no se secuenciara ese nucleótido.
Se pueden comparar luego distintos fragmentos para identificar polimorfismos.
Si aparecen dos nucleotidos en la misma posición (misma long de fragmento o pico) es que el individuo es heterocigoto para ese nucleótido, hay un polimorfismo.
A
Método de terminación de la cadena o método didesoxi (sanger)
Utiliza la electroforesis.
Procedimiento
1. El fragmento de ADN a secuenciar se mezcla con ADN polimerasa, los 4 tipos de nucleotidos (dNTP) y un premier o cebador (especifico del fragmento que se quiere replicar).
2. Esta mezcla se divide en 4 (una por cada tipo de nucleótido) y a cada una se le añade un tipo de didesoxiribonucleotidos trifosfato (ddNTP)
que no tienen grupo OH en extremo 3´ sino un H por lo que la polimerasa no puede continuar la replicación tras estos nucleotidos.
3
Comienza la replicación a partir del extremo 3´ del OH libre del cebador y la polimerasa va añadiendo nucleotidos.
3.1 Llegado un punto se introduce de forma aleatoria un ddNTP complementario a su nucleótido en la cadena base y se detiene la replicación.
3.2 Esto ocurre en cada una de las 4 reacciones (cada reacción tendrá fragmentos con mismo nucleótido de terminación)
, obteniendo diferentes fragmentos de distintos tamaños correspondientes a la separación entre el cebador y cada uno de los nucleotidos de la cadena.
4
Se realiza electroforesis o separación por tamaños y carga de los diferentes fragmentos obtenidos en gel de poliacrilamida.
5. Observando lo que avanza cada fragmento podemos extrapolar el orden de los nucleotidos;
los fragmentos mas pequeños avanzaran más, corresponden a los nucleotidos cercanos al cebador.
6
También se utilizan ddNTP marcados con fluoroforos (secuenciador automático), permiten realizar 4 reacciones juntas (todos ddNTP en misma reacción) y luego en electroforesis identificar el orden de nucleotidos según la fluorescencia captada por un láser.
B
Pirosecuenciación
Utiliza reacción cadena enzimática que libera luz según se incorporan los nucleotidos.
Procedimiento
1. El fragmento de ADN a secuenciar se mezcla con enzimas (ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, liciferasa y apirasa), con los 4 tipos de nucleotidos y un premier o cebador (especifico del fragmento que se quiere replicar).
2
Comienza la replicación a partir del extremo 3´ del OH libre del cebado y la polimerasa va añadiendo nucleotidos (dNTP) y liberando en cada uno pirofosfato inorgánico (PPi).
2.1 La ATP sulfurilasa cataliza conversión PPi en ATP en presencia de APS (adenosin fosfosulfato).
2.2 La luciferasa cataliza la conversión de luciferina oxiluciferina en presencia de ATP.
3. Esto libera energía en forma de luz que es detectada por el pirosecuenciador
. 3.1
Cada tipo de nucleótido libera una cantidad diferente de PPi, lo que varia la intensidad de la señal lumínica.
4. Si no se añade un nucleótido no se libera luz.
4.1 La apirasa degrada nucleotidos no añadidos.
Uso
Averiguar orden nucleotidos, detenccion metilaciones de nucleotidos (no se añade nucleótido) y SNP.
Método de clonación ADN basado en células
Permite amplificar fragmentos de ADN (genes) mayores de 1500-2000 pb que no se pueden procesar con la PCR.
Para ello se utiliza la tecnología del ADN recombinante, se combinan fragmentos de diferentes orígenes mediante enzimas de restricción y ADN ligasa. El nuevo fragmento contiene el vector unido al fragmento que se quiere amplificar (inserto)
, se introduce en una célula o bacteria donde se replica.
Usos
Amplificar fragmento ADN y obtener muchas copias. Aislar un fragmento de ADN del resto.
Genoteca:
Obtención de los fragmentos de ADN de interés para introducirlos luego en vector.
Conjunto de fragmentos diferentes copias del genotipo (conjunto de genes de un individuo).
Tipos
1
Genoteca genómica
Basada en la digestión con endonucleasas de restricción del material genético de una célula obteniendo muchos fragmentos. Se eligen los fragmentos que contienen el fragmento de interés y se introducen en un vector para su posterior clonación en células.
2
Genoteca de cDNA
Basada en la trascripción del material genético a ARNm, y este mediante retrotranscripcion inversa a ADN complementario (no contiene intrones o regiones no codificantes). Se eligen los ADNc que contienen el fragmento de interés y se introducen en un vector para su posterior clonación en células. Como ventaja el ADNc no puede ser eliminado por la bacteria tras la implantación por el vector debido a la ausencia de intrones.
Vectores
Cualidades indispensables
Poseen un marcador (secuencia codificante de genes) para diferenciarlos en la célula, tienen origen replicación independiente (Orí) del material genético de la célula, contiene diferentes secuencias de reconocimiento utilizadas por las distintas enzimas de restricción para cortar y añadir el fragmento deseado.
1
Plásmidos
Son cadenas de ADN circulares presentes en bacterias.
Permite añadir fragmento de 15000 pb.
Marcadores plasmidos:
Región codificante para un gen contenida en el plasmido.
A
Gen Amp
Permite identificar bacterias con plasmido (no si es o no recombinante). Codifica la resistencia al antibiótico ampicilina y permite proliferación. Si añadimos antibiótico al medio las bacterias que proliferen tendrán el plasmido.
B
Gen lacZ:
Permite identificar bacterias con plasmido recombinante. Codifica la producción de enzima β-galactosidasa que degrada X-Gal presente en el medio y produce tonalidad azul. Cuando se inserta el fragmento de ADN en el sitio de restricción el gen se altera y deja de producir la enzima, por lo que no se produce coloración. Si añadimos Xgal al medio las bacterias que no lo degraden (blancas) tendrán el plasmido recombinante.
Proceso
1. Las enzimas de restricción cortan el plasmido (en sitio restricción)
y el fragmento de ADN a amplificar, ambos se aparean espontáneamente por complementariedad de bases (puentes de H)
y la ADN ligasa une nucleotidos por enlaces fosfodiester.
2. Así se forma el plasmido recombinante.
3
Se introduce en la bacteria dado que esta lo capta del medio (transformación)
. Ahí se replica y se obtienen copias.
2
Otros vectores
2.1 Bacteriófagos:
El fragmento a replicar se inserta en virus, estos se reproducen e infectan a la bacteria insertando el fragmento. Permite añadir fragmentos de 23000 pb.
2.2 Cosmido:
Formado por capsulas de virus vacías en las que se introducen (contiene fragmento ADN a replicar), ahí se replican. Luego ataca a la bacteria e inserta plasmidos. Permite añadir fragmentos de 44000 pb.
2.3 Cromosoma artificial bacteriano:
Formado por plasmido F que controla replicación en bacterias al que se le introduce el fragmento a amplificar. La bacteria no puede introducirlo por transformación por su elevado tamaño, se introduce por electropulsacion, ahí se replica. Fragmentos de 300.000 pb.
2.4 Cromosoma artificial levadura:
Usado para introducir fragmento ADN (600.000 pb) deseado en célula eucariota en vez de bacteria. En la división celular se segrega como un cromosoma mas.
2.5 Vectores de expresión:
Se utilizan cuando en vez de replicar un determinado fragmento de ADN se busca producir una proteína en masa. Para ello a parte de contener el marcador (secuencia codificante de genes), el origen de replicación y los sitios de restricción contiene secuencias para la transcripción y traducción (así como la regulación)
del fragmento deseado.
Colony blot
Permite identificar que colonia contiene el fragmento de ADN (introducido con el vector) que nos interesa. Parecido a la hibridación southern blot con ADN en transferencia de membranas.
Procedimiento
1. Las bacterias que sabemos que contienen el ADN recombinante se siembran en una placa.
2. Cada bacteria proliferara y formara una colonia.
3. Se coloca membrana de nitrocelulosa encima de la placa a la que se adhieren bacterias de cada colonia haciendo una copia.
3. Se realiza hibridación de la membrana con disolución que contiene sonda (contienen fluoroforo) complementaria especifica del fragmento de interés. Se lava la membrana para eliminar sondas que no se unen.
4. Los fragmentos que han sido marcados se observara fluorescencia, pudiendo identificar las colonias que contienen el fragmento deseado.
Obtención de fármacos de origen biotecnológico
Basada en la tecnología del ADN recombinante (combinación de fragmentos de diferentes orígenes)
para producir proteínas (biofarmaco) en células.
Se utilizan vectores de expresión para inducir la producción de proteínas, contiene el fragmento de interés (codifica genes estructurales) junto regiones codificantes de genes reguladores (de transcripción y traducción), ademas del marcador, el origen de replicación y los sitios de restricción para las endonucleasas. Se introduce en la célula para producir una proteína.
Características
Proceso de estudio mas laborioso ya que se deben conocer las dianas terapéuticas basadas en la acción de proteínas (actúan como mensajeros) codificadas por ciertos genes o fragmentos de ADN sobre los receptores de las células. Estas generan cascada de señales intracelulares que desencadenan la acción terapéÚtica.
La estrucura de las proteínas es muy sensible a cambios en el entorno, por lo que deben manipularse con cuidado para que no pierdan su función terapéÚtica ya que no se unirán al receptor. La síntesis de proteínas no puede hacerse químicamente dada su complejidad, se realiza en cultivos celulares (bacterias o eucariotas).
En células de mamífero cuando se deben adicionar grupos no proteicos a las moléculas.
Los laboratorios trabajan con lineas celulares estudiadas y estandarizadas (contienen ADN recombinado), secreto empresarial, guardadas en nitrógeno liquido para largo plazo.
Fases del proceso
1
Cultivo:
Fase de proliferación celular.
Las células que contienen el ADN recombinante en su genoma (almacenadas en nitrógeno liquido) se ponen en depósitos con medio de cultivo (contiene todos los nutrientes necesarios) para que proliferen. Cel bacteriana se divide cada 20 min, mamíferos cada 24 h.
2
Fermentación
Se utilizan deposistos 10000L. Tras la proliferación las células transcriben su ADN recombinante a ARNm y este se traduce para formar proteínas terapéuticas.
3
Purificación
Se deseea aisar la proteína sintetizada y conseguir pureza del 99,9% para pasar control calidad. Depende si se encuentra en el interior celular (se deben lisar y separar) o si las secretan al medio (se filtran).
4
Formulación
Tras el aislamiento de la proteína se deben formular formas farmacéuticas que garantizen la reducida estabilidad de la estructura proteica y mantener intacta su actividad terapéÚtica. Normalmente formas para admin intravenosa y así liberar el producto directamente a circulación. Existen métodos como la pegilacion para aumentar la eficacia de las proteínas ya sintetizadas. Proceso que consiste en envolver la proteína en dos polietilenglicoles en su forma farmacéutica para protegerla del metabolismo y así aumenta su vida media, será necesario disminuir la posología (dosis e intervalo) manteniendo conc terapéuticas mas estables.
Insulina humana N-terminal
Primer biofarmaco creado por tecnología del ADN recombinante. La insulina esta formada por dos peptidos diferentes unidos por puentes disulfuro. Para ello se utilizaron 2 genes sintéticos insertados en diferentes vectores al lado de la región codificante del gen Lac (sintetiza enzima β-galactosidasa), diferentes procesos de síntesis. Se obtiene peptidos unido a la enzima, se trata con bromuro de cianógeno para separarlas. Luego tras la Purificación se mezclan ambos peptidos que forman los puentes disulfuro de forma espontanea conformando insulina.
Biofármacos
DIFERENCIAS ENTRE BIOFÁRMACOS Y FÁRMACOS DE SÍNTESIS QUÍMICA
CarácterÍSTICAS FARMACOCINÉTICAS DE LOS BIOFÁRMACOS
Cuando la cte de eliminación es mayor a la de absorción.
VENTAJAS/DESVENTAJAS DE BIOFÁRMACOS
1) VENTAJAS: EFICACIA Y SEGURIDAD
Gracias a su estructura, las proteínas tienen una afinidad fuerte por una molécula diana específica.
Son poco frecuentes la aparición de interferencias o interacciones peligrosas con otros fármacos, e incluso los efectos secundarios.
2) DESVENTAJAS:
Por su naturaleza, presentan una biodisponibilidad oral escasa.
Es más frecuente que desencadenen reacciones inmunes.
Tipos de biofarmacos
1
Anticuerpos monoclonales
Derivados del mismo linfocito B activado o célula plasmática, genera Ig (biofarmaco) especificas para el Ag que la activo en este caso para una proteína.
Uso
Tto neoplasias y artritis reumatoide.
Tipos
Murinos, quiméricos y humanizados.
Varían entre si en las regiones variables de la cadena ligera y pesada. a.
Murino:
Ratones se exponen al Ag o proteína, su sist inmune adaptativo responde y genera cel efectoras plasmáticas (linf B) entre otras. Se extraen las cel plasm del bazo junto con cel neoplásica (tasa replicación mas rápida) también linf B.
Se fusionan obteniendo hibridoma que produce la Ig y no puede morir por su alta tasa de replicación. LImitaciones: Los Ac murinos pueden producir respuesta hipersensibilidad en humanos.
B
Quimérico
Ac formado por regiones variables (determinan especificidad) de Ig murina y regiones constantes (determinan función) de humano.
C
Humanizados
Ac formado por regiones variables y constantes humanas (estructura completa human), pero dentro de estas las regiones hipervariables (determinan especificidad) provienen de Ig murina. Es menos probable que se produzcan reacciones de hipersensibilidad. d.
Otros
Regiones Fab (por encima de zona bisagra o enlaces fosfodiester): Menos problemas de hipersensibilidad.
Bevacizumab
Proteínas de fusión
Unión de fracciones de AC con fracciones de receptores o ligandos.
Abatacept
2
Citocinas
Mediadores de muchos procesos celulares, se unen a receptores de membrana que producen cascada de señales que finalizan con factores de transcripción que activan transcripción de genes y estos producen proteínas, por ello son de gran interés a la hora de producir biofarmacos. Efecto breve, se degradan con proteasas.
Tipos
A
Interferones
Tipo I (β y α) inhiben proliferación celular, tipo II (γ) activa macrofagos entre otras resp inmunes.
B
Factores estimuladores de la formación de colonias (CSF):
Regulan la producción de cel células hematopoyéticas como la EPO.
Epoetina (eritropoyetina de origen recombinante): estimula eritropoyesis. Precaución riesgo trombosis en pacientes con cáncer ya que cel tumorales poseen receptores parecidos.
Interleucina
Regula respuesta inmunitaria leucocitos y hematopoyesis.
C
Factor de necrosis tumoral (TNF-α):
Provoca necrosis en tumores y participa en la resp inmune (atracción leucocitaria por ejemplo).Hace referencia a la capacidad de esta citocina para provocar necrosis en algunos tumores pero participa también en la respuesta inmunitaria.
3. Enzimas:
Enzimas empleadas en TERAPIAS DE RESTAURACIÓN: tratamiento de cuadros de deficiencia congénita o adquirida de determinadas enzimas implicadas en pasos metabólicos específicos.
ENZIMAS ANTITROMBÓTICAS. Enzimas recombinantes que tienen por misión estimular el sistema fibrinolítico endógeno.
En cuanto a la especificidad, los agentes antitrombóticos pueden ser clasificados principalmente en: agentes inespecíficos o fibrinolíticos (estimulan la fibrinolisis donde existe plasminógeno) y los específicos o trombolíticos (activan la fibrinolisis donde hay fibrina).
FACTORES DE LA COAGULACIÓN SANGUÍNEA. Las formas recombinantes no presentan ventajas adicionales frente a productos obtenidos mediante extracción salvo la disponibilidad y la reducción del riesgo de contaminación biológica.
4
Proteínas hormonales
INSULINA. Todas las insulinas comercializadas tienen un origen biotecnológico.
Modificaciones en la estructura molecular de la insulina pueden adelantar el comienzo de la acción y emular el perfil cinético de la insulina fisiológica o producir un efecto mantenido a lo largo de más tiempo (liberación más lenta).
GONADOTROPINAS HIPOFISARIAS. Hormonas de naturaleza glucoproteica que actúan en la iniciación y regulación de la gametogénesis.
PROTEÍNA OSTEOGÉNICA 1: induce la formación de nuevo hueso fisiológicamente normal.
HORMONAS SECRETADAS POR EL LÓBULO ANTERIOR DE LA HIPÓFISIS:
La SOMATOTROPINA tiene un origen recombinante en todos los fármacos comercializados.
La HORMONA PARATIROIDEA ó PARATHORMONA (PTH) como estimuladora de la formación ósea.
5
Vacunas
Sólo una pequeña minoría de las vacunas comercializadas en
España son recombinantes.
Para virus que el sistema inmune no es capaz de eliminar totalmente en ocasiones, cronificándose la infección y con potencial tumoral que se puede manifestar a largo plazo.
Crecen mal en cultivos de tejido.
VIRUS DE LA HEPATITIS B (VHB). La partícula infectiva tiene forma esférica y presenta una capa lipídica externa en la que se insertan múltiples copias de la proteína viral, que es el antígeno de superficie para proteger frente a la infección clínica del VHB.
VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO. Presenta una capa externa formada por dos proteínas: L1 y L2. La L1 es la proteína más importante para inducir la respuesta inmunitaria protectora.
FÁRMACOS BIOSIMILARES
Las copias de los fármacos biotecnológicos se conocen como BIOSIMILARES.
Son producidos por un fabricante diferente del original, utilizando nuevas líneas celulares, nuevos procesos y nuevos métodos analíticos.
Pueden existir diferencias en cuanto al producto final que ocasionen ciertas carácterísticas específicas a nivel de la actividad del medicamento o la aparición de determinados efectos adversos por la inmunogenicidad que pueden desarrollar.
Ej: diferencias en la glucosilación de las epoetinas (eritropoyetinas) biosimilares pueden ocasionar diferencias de hasta un 20% en la actividad con respecto al original porque la glucosilación determina la actividad biológica de la proteína.
Otras aplicaciones de biotecnología
Pruebas genéticas
MICROSATÉLITES-PATERNIDAD
Los marcadores microsatélites también se conocen como STRs (Short Tándem Repeats).
Se emplean comúnmente en la identificación humana debido a que son muy polimórficos (gran poder de discriminación), tasa de mutación relativamente baja, tamaño pequeño y ubicación cromosómica establecida.
Varios de estos marcadores pueden amplificarse mediante PCR de forma simultánea (multiplex).
El CODIS (Combined DNA Índex System), es la base de datos de DNA creada por el FBI (USA).
El CODIS utiliza un conjunto estándar de 13 regiones STRs específicos.
AMELOGENINA Discriminación del sexo
MICROSATÉLITES-PATERNIDAD Número de alelos para cada locus STR del CODIS
ACTIVIDAD MICROSATÉLITES-PATERNIDAD
Primer paso: Elaboración del árbol genealógico de una familia
Segundo paso: Recopilación datos análisis STR
Ejercicio: recopilar la información de los 3 marcadores para todos los individuos de la familia de Bob.
Ejercicio1 : Con la información de los 13 marcadores y la amelogenina, ¿apoyan todos los datos sobre los genotipos de Bob, Ana, María, y David la posibilidad de que Bob y Ana son los padres biológicos de María y David?
Ejercicio 2: Con la información de los 13 marcadores y la amelogenina. Los alelos que Bob transmite a sus descendientes los heredó a su vez de Alfredo y Nuria. Identificar los alelos de los genotipos de María y David que se han heredado sin ambigüedad de cada uno de sus abuelos paternos.
Ejercicio 3: Con la información de los 13 marcadores y la amelogenina. Si no se conoce el perfil genético de Esteban pero se sabe con certeza que es el padre de Teresa, Mónica y Esther junto con su mujer Luisa, ¿qué predicciones podríamos hacer acerca de su composición para cada uno de estos marcadores?
Clonación de organismos
“Desde el punto de vista genético un clon no es otra cosa que un gemelo que viene al mundo con retraso” (Jens Reich).
Primeros animales en ser clonados: ranas.
Primer mamífero clonado: DOLLY en el Instituto Rosalina (Escocia).
Procedimiento:
– Extracción de células de glándula mamaria de oveja
– Cultivo celular
– Núcleos celulares se inyectan en óvulo enucleado de otra raza de oveja
– Desarrollo embrionario que da lugar a oveja clonada (Dolly: 5 de Julio de 1996)
Dolly: clonación a partir de una célula de glándula mamaría por transferencia de su núcleo a un óvulo enucleado.
CONCLUSIONES:
Una célula somática puede “olvidar” todas las especificidades (diferenciación) y actuar como si fuera un óvulo fecundado “totipotente”.
Procedimiento poco eficiente: la mayoría de ovejas gestantes tuvieron abortos.
Se ha descubierto que algunos animales clonados poseen telómeros más cortos que sus congéneres de la misma edad.
DIFICULTADES:
– El núcleo celular procede de una célula corporal diferenciada, en la cual ciertos genes están bloqueados. Para poder reprogramar el DNA bloqueado se deben mantener los núcleos de las células somáticas en un medio de cultivo pobre en nutrientes.
– El núcleo celular del donante está dañado de antemano por la luz UV, radicales de oxígeno reactivo (ROS) y sustancias tóxicas.
– La interacción entre óvulos enucleados y núcleos celulares no funciona sin fallos. El plasma celular del óvulo controla la función del núcleo celular correspondiente.
– El clon no es una copia exacta del donante: el DNA mitocondrial procede de la donante de óvulos. Clon genómico.